本文構(gòu)建了液相色譜法同時檢測咖啡豆中6種主要的酚酸類化合物:咖啡酸(caffeicacid)、3-咖啡?？崴?/span>(3-O-caffeoylquin-icacid，3-CQA)、4-咖 啡 酰 奎 尼 酸(4-O-caf-feoylquinicacid，4-CQA)、5-咖 啡 酰 奎 尼 酸(5-O-caffeoylquinicacid，5-CQA)、3，5-二咖啡酰奎尼酸(3，5-O-dicaffeoylquinicacid，3，5-diCQA)、4，5-二咖啡酰奎 尼 酸(4，5-O-dicaffeoylquinicacid，4，5-diCQA) ，對我國咖啡豆原料及其制品的質(zhì)量控制、資源合理開發(fā)利用具有重要的指導意義。
1實驗部分
1．1儀器、試劑與材料
液相色譜儀LCsolu-tion色譜數(shù)據(jù)工作站;梅特勒電 子 天 平(1/10000) ;超聲波清洗器;純 水 機。
5-CQA、咖啡酸對照品，3-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA對照品，4-CQA對照品，所有對照品純度均大于或等于98%;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為超純水。咖啡豆樣品于2009年10月收集于云南麗江、德宏、保山、思茅4個產(chǎn)區(qū)各種植園(樣品粉碎過20目篩，室溫避光保存)。
1．2色譜條件
色譜柱:KromasilC18柱(200mm×4.6mm，5μm) ;柱 溫25°C;進 樣 量:10μL;流 動 相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。洗脫程序:0～42min，5%B～25%B;43～46min，25%B;47～50min，25%B～50%B;51～52min，50%B;53～55min，50%B～5%B;56～60min，5%B。流速:1.0mL/min;檢測波長:325nm。
1．3對照品貯備液的制備
精密稱取咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA對照品適量，分別置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到各對 照 品 貯 備 液。其質(zhì)量濃度依次為:103.20、337.68、208.15、447.90、166.67和206.15mg/L。再分別吸取咖啡酸0.01mL、3-CQA0.05mL、4-CQA0.05mL、5-CQA0.1mL、3，5-diCQA0.05mL、4，5-diCQA0.04mL充分混勻，得混合對照品貯備液，各組分相應質(zhì)量濃度依次為:3.44mg/L、56.28mg/L、34.69mg/L、149.30mg/L、27.79mg/L和27.49mg/L。
1．4供試品溶液的制備
精密稱取0.25g咖啡豆碎末，置于100mL錐形燒瓶中，加入70%甲醇25mL，室溫下超聲提取30min，過濾冷卻定容于50mL容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，即為供試品溶液。
2結(jié)果與討論
2．1樣品前處理方法的優(yōu)化
2．1．1提取溶劑的考察
實驗分別比較了同等處理條件下，水、50%甲醇、70%甲醇對綠咖啡豆中酚酸類物質(zhì)的提取效果。結(jié)果顯示50%甲醇提取物中酚酸類物質(zhì)的含量為4.36%，明顯高于水提物的3.26%，而70%甲 醇 比50%甲醇提取物中酚酸類物質(zhì)的含量高0.20%。為了使樣品中的目標物盡可能地*提取出來，本實驗zui后選用70%甲醇作為提取溶劑。
2．1．2提取方法的考察
比較了同等處理條件下70%甲醇超聲法和回流法兩者的提取效果。經(jīng)測定，超聲法與回流法提取物中酚酸類化合物的含量分別為4.54%和4.21%，前者略高于后者且超聲提取法操作簡便、快速。此外，文獻報道綠原酸類化合物具有熱不穩(wěn)定性［2］，選擇在室溫下超聲提取更利于減少有效成分的損失。
2．1．3提取次數(shù)及時間的考察
比較了同等處理條件下70%甲醇超聲提取一次(30min)和超聲提取兩次(30min+15min)兩者的提取效果，結(jié)果表明超聲30min能夠*提取出咖啡豆中的酚酸類物質(zhì)。
2．2線性關(guān)系及檢出限
精密量取1.3節(jié)所述混合對照品貯備液，逐級稀釋配制成不同濃度的混合對照品工作液，分別進樣20μL，記 錄 峰 面 積。以 各 對 照 品 質(zhì) 量 濃 度(mg/L)X為橫坐標，其峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得到6種酚酸類物質(zhì)的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以儀器信噪比(S/N)確定6種化合物的zui低檢出限(LOD，S/N=3) ，見表1。
2．3精密度試驗
取1.3節(jié)所述混合對照品貯備液，在上述色譜條件下進樣10μL，重復進樣6次，測定峰面積。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diC-QA峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.90%、0.85%、0.94%、0.81%、1.08%和0.83%。
2．4重復性試驗
精密稱取咖啡豆碎末(云南麗江)共6份，按1.4節(jié)方法制備供試液，在1.2節(jié)色譜條件下進樣10μL，測得咖啡酸的平均含量為0.46mg/L，RSD為0.75%;3-CQA的平均含量為11.14mg/L，RSD為1.51%;4-CQA的平均含量為15.72mg/L，RSD為1.80%;5-CQA的 平 均含 量 為139.18mg/L，RSD為2.08%;3，5-diCQA的 平 均 含 量 為13.96mg/L，RSD為1.29%;4，5-diCQA的 平 均 含 量 為13.79mg/L，RSD為1.45%。
2．5穩(wěn)定性試驗
取同一供試樣品提取液，在室溫中放置，分別在0、2、4、6、8、12h進樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA峰 面 積的RSD分 別 為2.0%、1.6%、1.9%、1.2%、1.9%和2.2%。結(jié)果表明6種化合物溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2．6加樣回收率試驗
取0.25g已知6種酚酸含量的云南麗江咖啡豆樣品9份，分別加入混合對照品溶液(混合對照品溶液按1．3節(jié)所配制各對照品貯備液等量混勻制備，各組分質(zhì)量濃度為:3-CQA56.28mg/L、5-CQA74.65mg/L、4-CQA34.69mg/L、咖 啡 酸17.20mg/L、3，5-diCQA27.78mg/L、4，5-diCQA34.36mg/L)1、2、3mL，每組3份，按1.4節(jié)方法制備供試液進樣分析，計算各組分的加標回收率(見表2)。
2．7樣品含量測定
采用上述建立的分析方法，測定了云南德宏、思茅、保山及麗江4個產(chǎn)地的綠咖啡豆中6種酚酸類化合物的含量(見表3)。樣品檢測前均置于烘箱中同等溫度、時間(60°C，1h)烘干處理，以保證各樣品中水分含量基本一致。6種酚酸類化合物混合標準溶液和咖啡豆樣品的色譜圖見圖2。樣品檢測情況顯示，不同產(chǎn)地的咖啡豆中6種酚酸類化合物的含量差異明顯，其主要原因可能是由于原料品種、產(chǎn)地土壤栽培及氣候條件的不同，同時，也與原料采收時期及采后加工工藝有著密切關(guān)系。另外，云南4個產(chǎn)區(qū)的樣品中3-CQA、4-CQA、5-CQA的含量普遍偏高，保山咖啡豆中的5-CQA的含量尤為顯著，這為深入開發(fā)云南咖啡豆資源，尤其是保山潞江壩產(chǎn)區(qū)原料提供了重要參考。
3結(jié)論
綠原酸類化合物的分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多個酚羥基，其水溶液在中性和堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差，本實驗選用0.1%甲酸和乙腈作為流動相，抑制羧基和酚羥基電離，并針對咖啡豆中主要的酚酸類化合物特性對梯度洗脫程序作了相應的調(diào)整，建立了同時測定咖啡豆中6種酚酸類化合物的液相色譜方法。該法簡便、快速、靈敏度高，適用于咖啡豆中6種酚酸類化合物的同時分析以及咖啡豆原料與制品的質(zhì)量控制和綜合評價。在本文研究基礎上，就如何有效提高綠咖啡豆中酚酸類化合物等多種營養(yǎng)物質(zhì)的含量及生物利用度，促進我國咖啡豆資源的深度綜合開發(fā)，加強產(chǎn)品在世界范圍的競爭力，本課題組將進行更為系統(tǒng)的植物資源與化學研究。
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