安捷倫液相色譜儀HPLC測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠
孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類(lèi)化學(xué)物，既是染料，也是殺菌劑，可致癌?？兹甘G可用作治理魚(yú)類(lèi)或魚(yú)卵的寄生蟲(chóng)、真菌或細(xì)菌感染，對(duì)付真菌Saprolegnia特別有效，漁場(chǎng)的魚(yú)卵會(huì)感染這種真菌?？兹甘G也常用作處理受寄生蟲(chóng)影響的淡水水產(chǎn)。用作抑菌劑或殺阿米巴原蟲(chóng)劑；對(duì)脂鯉和鯰魚(yú)等海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，有高度毒性、高殘留等副作用，故使用時(shí)，通常只下一半份量。但一些水產(chǎn)品販運(yùn)商為保持水產(chǎn)品新鮮度普遍用MG消毒車(chē)廂和活魚(yú)池；酒店為了延長(zhǎng)魚(yú)的存活時(shí)間也在魚(yú)池中投放MG進(jìn)行消毒。使用MG消毒后的魚(yú)即使死亡后顏色也較為鮮亮，消費(fèi)者很難從外表進(jìn)行辨認(rèn)。雖然MG已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，但因?yàn)槠鋬r(jià)格低廉，同時(shí)目前在水霉病防治上尚無(wú)其它有效藥品，因此仍有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖戶(hù)在普遍使用。
孔雀綠石
材料與方法
1. 1材料
1.1.1試劑
乙睛 色譜純，fishte ；
乙酸銨 ，hplc純 ，DIKMA；
孔雀石綠（MG） sigma試劑；
無(wú)色孔雀石綠（LMG） sigma試劑。
0.125mol/L乙酸銨溶液 稱(chēng)取乙酸銨9.64 g，用純水溶解并定容至1000mL。用0.45μm濾膜過(guò)濾。
MG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱(chēng)取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1mg/mL。避光、冰箱冷凍層保存。
MG標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 吸取1mg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
LMG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱(chēng)取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100mL。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1mg/mL。
LMG標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 吸取1mg/mL無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液 分別吸取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙睛稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。
1.1.2 儀器
安捷倫液相色譜儀。具UV-VIS、在線脫氣機(jī)、高壓泵、柱恒溫箱、色譜工作站。
1.2 步驟
1.2.1 色譜條件
檢測(cè)器 紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，波長(zhǎng)618nm；
色譜柱 氰基柱，4.6mm×250mm，5μm；
流動(dòng)相 乙睛-0.125mol/L乙酸銨（pH4.5）=（47+53）；
柱溫 35℃；
進(jìn)樣量 20μL。
1.2.2 測(cè)定步驟
吸取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（5.0μg/mL）注入色譜儀，在上述色譜條件下，繪制色譜圖。見(jiàn)圖1。
（安捷倫液相色譜儀）
2.結(jié)果與討論
2.1流動(dòng)相的選擇 MG和LMG的HPLC法分離，無(wú)論是C18柱還是氰基柱，多采用乙睛和乙酸銨作流動(dòng)相的反相體系（1～4）。其中乙酸銨濃度對(duì)MG和LMG的分離有很大影響。對(duì)于梯度洗脫方式多采用50mmol/L乙酸銨溶液（2、3），而等梯度洗脫方式乙酸銨溶液濃度較大（0.125mol/L）（1）。
2.2 流動(dòng)相溶劑比例的影響 在上述色譜條件下，用1.0μg/mL MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液在不同比例（V/V）乙睛-0.125mol/L乙酸銨溶液中觀察分離效果，結(jié)果表明，在乙睛-乙酸銨溶液（pH4.5）=47+53時(shí)分離效果好，靈敏度zui高，所以選擇該溶劑比為流動(dòng)相為。見(jiàn)表1。
2.3zui低檢測(cè)濃度 在上述色譜條件下，以3S/N的響應(yīng)信號(hào)為zui低檢測(cè)濃度，LMG的zui低檢測(cè)濃度為0.02μg/mL，MG的zui低檢測(cè)濃度為0.05μg/mL。均能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。見(jiàn)圖2。
由圖可見(jiàn)，以取樣量10.0g計(jì)，zui低檢測(cè)濃度LMG為2μg/kg，MG為5μg/kg。
2.4 線性范圍試驗(yàn) 在上述色譜條件下，LMG和MG線性關(guān)系均良好。LMG和MG線性范圍為2μg/mL～160.0μg/mL，r ＞0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL～10.0μg/mL范圍的校正曲線見(jiàn)圖3；1.0μg/mL～160.0μg/mL范圍的校正曲線見(jiàn)圖4。
2.5精密度試驗(yàn)
在上述色譜條件下，分別用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行性測(cè)定。保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。見(jiàn)表2。
3樣品測(cè)定
3.1 樣品處理
3.2樣品測(cè)定
3.2.1校正曲線的繪制
3.2.2樣品測(cè)定
3.3 加標(biāo)回收率測(cè)定
4結(jié)論
LMG和MG毒性強(qiáng)、具有很高的三致作用，其對(duì)水產(chǎn)品的人為污染應(yīng)受到嚴(yán)重關(guān)切。
液相色譜儀測(cè)定水產(chǎn)品中LMG和MG，具有方法簡(jiǎn)便、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑、精密度高、靈敏準(zhǔn)確、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中LMG和MG含量檢測(cè)。
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