液相色譜儀HPLC測(cè)定石杉?jí)A甲的含量
石杉?jí)A甲是石杉科植物中提取的一種生物堿，是一強(qiáng)效的膽堿酯酶可逆性抑制劑，其作用特點(diǎn)與新斯的明相似，但作用維持時(shí)間比后者為長(zhǎng)。對(duì)真性膽堿酯酶具有選擇性的抑制，抑制強(qiáng)度是假性膽堿酯酶的數(shù)千倍；抑制方式為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制，與單純競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑有顯著不同；易通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，兼具有中樞及外周治療作用；有效時(shí)間長(zhǎng)；從胃腸道吸收良好；安全指數(shù)大；穩(wěn)定性好。
由于蕨類(lèi)植物生長(zhǎng)緩慢，繁殖困難，造成了石杉?jí)A甲的原料藥價(jià)格昂貴，因此，建立一個(gè)石杉?jí)A甲含量的快速檢測(cè)方法很有必要。為了科學(xué)、合理地利用石杉屬植物資源，采用HPLC法對(duì)石杉中石杉?jí)A甲的含量進(jìn)行測(cè)定，為尋找和篩選石杉?jí)A甲新的植物資源提供科學(xué)依據(jù)。
1、儀器與試藥
安捷倫液相色譜儀HPLC((帶四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器等);梅特勒天平;KQ50B超聲清洗器;電熱恒溫水浴鍋;石杉?jí)A甲對(duì)照品(100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)藥材采至貴州黔東南，由貴州科學(xué)院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉，標(biāo)本存放于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥研究所，標(biāo)本憑證(20056)。
昆明石杉
2、液相色譜儀HPLC測(cè)定石杉?jí)A甲的含量方法與結(jié)果
2.1色譜條件
ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈 (92∶8)，檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm，流速1ml·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量為5μl。在此色譜條件下，樣品中的石杉?jí)A甲與其他峰能達(dá)到基線(xiàn)分離， 其理論塔板數(shù)為4656，對(duì)稱(chēng)因子為0.92。石杉?jí)A甲的保留時(shí)間為11.15min。
2.2樣品的制備
精密稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)藥材細(xì)粉2g于500ml的圓底燒瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次，合并濾液并 回收溶劑，加入2%的酒石酸溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0，再用氯方萃取至Dragendorffors反應(yīng)呈陰性，揮干有機(jī)溶劑，用無(wú)水乙醇溶解并定 容至25ml即得。
2.3線(xiàn)性關(guān)系的考察
精密稱(chēng)取石杉?jí)A甲對(duì)照品2.40mg于25ml容量瓶中以無(wú)水乙醇溶解并定容，得濃度為0.096mg·ml-1對(duì)照品溶液，再分別稀釋成 0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的對(duì)照品供試液，在色譜條件下測(cè)定。以進(jìn)樣濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回 歸，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995?？芍?jí)A甲在0.015～0.48μg之間與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。
2.4精密度實(shí)驗(yàn)
取石杉?jí)A甲對(duì)照溶液，在色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果石杉?jí)A甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。
2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取供試品溶液，每隔2h測(cè)定1次，考察石杉?jí)A甲的含量變化，結(jié)果含量的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品在10h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
精密稱(chēng)樣品6份，按“2.2”項(xiàng)的要求制備6份供試液，在色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。
2.7回收率實(shí)驗(yàn)
精密稱(chēng)取昆明石杉藥材細(xì)粉6份，每份1g，分別加入對(duì)照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml，按樣品制備方法和色 譜條件，制備加樣回收供試液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率(見(jiàn)表1)。結(jié)果石杉?jí)A甲的平均回收率為99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉?jí)A甲加樣 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
2.8樣品的測(cè)定
按“2.2”項(xiàng)的要求精密稱(chēng)取樣品3份，制備供試液，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值，石杉?jí)A甲在原植物中的平均含量為0.03%。
3、液相色譜儀HPLC測(cè)定石杉?jí)A甲含量的結(jié)論
我們建立了用HPLC反相柱從石杉總堿中直接測(cè)定石杉?jí)A甲的方法，該方法線(xiàn)性與精密度良好，平均回收率為99.89%，平均RSD為0.40%。實(shí)驗(yàn)證明該方法易行、靈敏、準(zhǔn)確、可靠。在生產(chǎn)石杉?jí)A甲的工作中得到了證實(shí)。
測(cè)定方法是在其它石杉中石杉?jí)A甲含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動(dòng)相。
從石杉?jí)A甲原植物中提取總生物堿，是一個(gè)常規(guī)和穩(wěn)定的方法。通過(guò)測(cè)定總堿中石杉?jí)A甲的含量，便可以推算出原植物中石杉?jí)A甲的含量。該方法已經(jīng)成為檢定原植物的方法并應(yīng)用于工作中。
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